作业帮在测序前如何进行pcr产物的酶切纯化,注意我想知道的是用于测序的pcr产物酶切纯化,不是用于克隆的酶切.
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/13 09:09:06
在测序前如何进行pcr产物的酶切纯化,注意我想知道的是用于测序的pcr产物酶切纯化,不是用于克隆的酶切.
在测序前如何进行pcr产物的酶切纯化,注意我想知道的是用于测序的pcr产物酶切纯化,不是用于克隆的酶切.
在测序前如何进行pcr产物的酶切纯化,注意我想知道的是用于测序的pcr产物酶切纯化,不是用于克隆的酶切.
这种方法有比较大的局限性,要求pcr产物条带要单一,如果有杂带的话测序结果肯定就是一堆的套峰了.
这种方法是采用虾碱酶（SAP,Shrimp Alkaline Phosphatase）和外切酶I的混合溶液,来消化pcr扩增体系中多余的dNTPs和引物,以便后面的测序.一般使用的终浓度为1ul混合溶液中,含有虾碱酶0.6单位,外切酶I1.2个单位,这个比例也可以自己通过试验来调整.
一般是1ulpcr产物加2ul溶液.37度孵育15分钟,即可除去多余的引物以及dNTPs,然后80度,15分钟就可以使虾碱酶失活.
这个方法的优点是简单、快速、省钱、不损失样品,缺点是对样品要求高,如果一次纯化测序结果不好还要重来,费时费力.所以现在测序公司一般都是使用胶回收试剂盒来纯化,这样虽然工作量比较大,费钱,但基本可以保证一次成功,总体看来还是省时省力的.
你说的两者并没有本质区别。可以有几种方法来纯化：
最简单的：酶切完成后，做一个有双排孔的胶（也有卖的）。把要分离的混合物加在上一排，然后跑电泳，随时观察，等要纯化的那个条带抛入下一排的孔时，切断电源，直接吸出来就可以了。可以用来直接测序。
或者使用PCR 纯化试剂盒，一般都可以清除切下来的小片段核酸。要注意的是最后一步洗脱液内不要有EDTA （比如TE缓冲液），有可能干扰测序的酶活...
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你说的两者并没有本质区别。可以有几种方法来纯化：
最简单的：酶切完成后，做一个有双排孔的胶（也有卖的）。把要分离的混合物加在上一排，然后跑电泳，随时观察，等要纯化的那个条带抛入下一排的孔时，切断电源，直接吸出来就可以了。可以用来直接测序。
或者使用PCR 纯化试剂盒，一般都可以清除切下来的小片段核酸。要注意的是最后一步洗脱液内不要有EDTA （比如TE缓冲液），有可能干扰测序的酶活性。
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楼上t说的是一t方6面。 PCR产物测序也x是可以5的，可以8送粗样，也o就是不n纯化8的，也h可以2送纯化6好的。但很多公1司测的不d是很好，所以7一l般建议转到克隆载体中3保存了t送菌液或质粒测序。 PCR产物纯化4是去除多余的dNTP和引7物二e聚体。用纯化4好的片6段连接转化1可以3降低背景，提高转化3效率。通常转化0后我们用几r种方0法来确认6转化7子n，抽质粒酶切3是比6较可靠的。选择...
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楼上t说的是一t方6面。 PCR产物测序也x是可以5的，可以8送粗样，也o就是不n纯化8的，也h可以2送纯化6好的。但很多公1司测的不d是很好，所以7一l般建议转到克隆载体中3保存了t送菌液或质粒测序。 PCR产物纯化4是去除多余的dNTP和引7物二e聚体。用纯化4好的片6段连接转化1可以3降低背景，提高转化3效率。通常转化0后我们用几r种方0法来确认6转化7子n，抽质粒酶切3是比6较可靠的。选择酶切5大k小w与z预计4一d致的克隆去测序。
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